一、微生物生长控速的目的

微生物发酵过程中进行控速的目的是多方面的，主要可以归结为以下几点：

1.优化生长条件：微生物的生长和代谢受到多种环境因素的影响，包括温度、pH值、溶解氧、基质浓度等。通过控速，可以调整和优化这些环境因素，为微生物提供稳定的生长条件，从而促进其快速生长和高效代谢。

2.提高产物产量：在发酵过程中，微生物会合成目标产物（如抗生素、酶、有机酸等）。控速可以确保微生物在一定状态下进行代谢活动，从而提高产物的合成速率和产量。如果发酵速度过快，可能会导致底物迅速耗尽，产生抑制微生物生长的副产物，或者使微生物提前进入衰亡期，降低产物产量。

3.保持发酵稳定性：发酵过程的稳定性对于确保产物的质量和产量至关重要。通过控速，可以维持发酵过程中的各种参数在稳定范围内，避免剧烈波动对微生物生长和代谢产生不利影响。这有助于减少发酵失败的风险，提高生产效率和经济效益。

4.节约能源和资源：在发酵过程中，需要消耗大量的能源和资源（如电力、蒸汽、底物等）。通过合理的控速，可以优化能源和资源的利用效率，减少浪费和成本。例如，在溶解氧控制方面，通过精确调节通气量和搅拌速度，可以确保发酵液中的溶解氧浓度维持在适宜范围内，避免过度通气造成的能源浪费和底物氧化损失。

5.应对不同发酵阶段的需求：发酵过程通常包括适应期、对数生长期、稳定期和衰亡期等不同阶段。每个阶段对环境条件和营养物质的需求不同。通过控速，可以根据不同发酵阶段的需求调整发酵条件，确保微生物在每个阶段都能获得稳定的生长和代谢环境。

Tips：耀海生物通过优化基础培养基、补料培养基和发酵控制策略，建立了适用于质粒生产的大肠杆菌高密度发酵平台工艺，培养周期30h内，质粒产量超过1g/L。

此外，耀海生物能够针对不同的质粒和宿主菌，基于单因素或DoE方法提供工艺优化解决方案，定制化满足质粒高产量、高质量需求。

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二、发酵过程控速的直接原因

2.1剪切力

由于某些微生物比较脆皮，高转速可能会导致微生物的破裂：

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细胞破裂：

・高剪切力可能直接导致微生物细胞壁的破裂，释放出细胞内的物质。这不仅会影响微生物的存活率，还可能对后续的发酵或处理过程产生不利影响。

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代谢产物泄漏：

・细胞破裂后，细胞内的代谢产物会泄漏到环境中。这些代谢产物可能具有生物活性或毒性，对环境和人类健康造成潜在威胁。

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发酵效率降低：

・如果大量微生物细胞在发酵过程中破裂，会导致发酵液中细胞浓度的降低，从而影响发酵效率和产物产量。

2.2氧中毒

对于好氧微生物来说，氧中毒的机理主要涉及氧自由基的过量生成与损害以及抗氧化防御系统的失衡。在高氧浓度或压力下，好氧微生物可能面临氧化应激的风险，导致细胞结构和功能的破坏以及细胞死亡。因此，在培养和应用好氧微生物时，需要控制适当的氧气浓度和压力条件，以确保其正常生长和代谢活动。因此需要通过限制通气比进行控速发酵。

a.在高通气状态下：如果微生物所处的环境中氧气浓度过高，可能会对其造成损害，甚至导致死亡。这种损害机制可能与氧自由基的生成和攻击有关。

b.控制通气量：在发酵过程中，应根据微生物的需求和耐受性合理控制通气量，避免过高或过低的氧气浓度。

c.监测氧浓度：定期监测发酵液中的氧浓度，确保其在适宜的范围内。

d.优化发酵条件：除了通气量外，还应关注其他发酵条件如温度、pH值、底物浓度等，以创造适合微生物生长和产物合成的环境。

e.加强设备维护：确保发酵设备处于良好状态，避免设备故障导致通气量异常。

2.3底物抑制

高浓度底物会抑制微生物代谢，主要是因为以下几个方面：

1. 底物浓度的增加会导致溶液的渗透压升高，从而影响微生物的生长和繁殖。高浓度的底物会抑制微生物的生长和繁殖，因为过高的渗透压会破坏细胞膜，导致细胞失水或过度吸水，从而对细胞的正常功能产生影响。

2. 高浓度的底物可能会导致代谢途径的饱和。当底物浓度达到一定水平时，相应的酶可能会达到饱和状态，从而导致底物浓度进一步增加时，反应速度不再增加。

3. 高浓度的底物还可能会诱导产生代谢 overflow现象。当底物浓度过高时，微生物可能会启动不必要的代谢路径，导致能量浪费和副产物的生成，这也会影响目标产物的的学习。

在微生物代谢研究中，控制底物浓度对于调节代谢途径、提高目标产物产量和效率具有重要意义。

2.4产物抑制

产物浓度过高会显著抑制微生物的生长与代谢，减缓发酵速率，甚至导致发酵失败。高浓度产物可能直接毒害细胞，影响酶活性和代谢途径，同时增加发酵液渗透压，破坏细胞平衡。因此，控制发酵速率至关重要，通过调节培养条件、添加抑制剂等手段，维持适宜的产物生成速度，防止过度积累。同时，提升产物分离速率，实现边发酵边分离的耦合工艺，能有效降低产物浓度，减轻抑制作用，保障发酵过程稳定进行，提高产物产量与品质。解决方案以耦合发酵或灌流培养为主。

耦合发酵工艺，即边发酵边分离的技术，是一种将发酵过程与产物分离过程紧密结合的先进工艺。它通过在发酵过程中采用适当的分离技术，如膜分离、萃取等，实时将产物从发酵液中分离出来，从而有效降低产物浓度，解除对微生物的抑制作用，提高发酵效率和产物产量。这种工艺不仅优化了发酵过程，还提高了产品的纯度和回收率，是现代生物发酵工业的重要发展方向。

2.5畸形合成

a.mRNA稳定性下降：在快速生长的条件下，细胞内的mRNA稳定性可能会受到影响，导致与蛋白质合成相关的mRNA降解速度加快。这将减少可用于翻译的mRNA数量，进而影响蛋白质的合成。

b.核糖体功能受损：虽然核糖体本身不会因生长速率过快而直接减少，但快速生长可能导致的代谢压力增加和资源分配不均等问题可能间接影响核糖体的功能。例如，核糖体可能无法获得足够的能量或氨基酸来支持高效的蛋白质合成。

c.蛋白质折叠和修饰异常：由于缺乏高尔基体和内质网，在快速生长的细胞可能无法为新生蛋白质提供足够的折叠和修饰环境。这可能导致蛋白质无法正确折叠成具有生物活性的构象，或者无法获得必要的糖基化、磷酸化等修饰，从而影响其功能和稳定性。

由于以上所述原因，对于原核类微生物来说通过调整培养基成分、补料策略、温度等方式来控制微生物的生长速率，有助于保持细胞内的代谢平衡和基因表达调控的稳定，从而提高蛋白质的合成效率和质量。

2.6能量分配与物质分配

在微生物工艺中，控速发酵是确保各阶段平衡的关键。通过精细调控发酵速率，可以优化时间、生物量、营养和能源的分配。通过分段工艺设计，综合考虑微生物生长周期，维持适宜的生长条件，避免过快或过慢导致资源浪费或产物抑制。控速发酵旨在实现资源较大化利用，提高产物质量和产量，是现代生物发酵工业的重要策略。

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三、控速策略

微生物发酵控速的逻辑很大程度上是围绕控制微生物体内酶催化反应的速率来展开的。酶是生物体内催化化学反应的蛋白质，它们能够加速反应进程而不改变反应的总能量变化。在微生物发酵过程中，酶催化反应的速率直接影响着代谢产物的生成速度和发酵效率。快速且稳定的酶催化反应速率有助于提高发酵效率，减少发酵时间，并可能提高产物的纯度和产量。

3.1温度控制

酶的活性受温度影响显著。一般来说，每种酶都有其适温度范围，在此范围内酶活性高，反应速率快。因此，通过控制发酵温度，可以调控酶催化反应的速率。

例如，对于某些需要高温发酵的微生物，可以提供适宜的高温环境来加速酶催化反应；而对于需要低温发酵的微生物，则需要保持较低的温度以维持酶的活性。

3.2pH值调控

酶的活性也受pH值的影响。每种酶都有其较适pH值范围，偏离此范围酶活性会下降甚至失活。因此，通过调控发酵液的pH值，可以影响酶催化反应的速率。可以定期检测发酵液的pH值，并根据需要添加酸碱调节剂来保持较适发酵状态。

3.3底物浓度与营养条件

底物浓度是影响酶催化反应速率的重要因素之一。底物浓度过高可能导致底物抑制效应，降低反应速率；而底物浓度过低则可能限制反应速度。因此，需要控制底物的投加量和投加速度，以维持适宜的底物浓度范围。

此外，微生物在发酵过程中还需要一定的营养物质来维持其生长和代谢活动。提供充足的营养物质有助于提高酶催化反应的速率和效率。

3.3溶氧量与通气量

对于好氧微生物来说，溶氧量是影响其代谢活动的重要因素之一。通过控制通气量和搅拌速度等参数，可以调控发酵液中的溶氧量水平，从而影响酶催化反应的速率。一般来说，在好氧发酵过程中需要保持较高的溶氧量水平以促进微生物的生长和代谢活动；而在厌氧发酵过程中则需要保持较低的溶氧量水平以避免氧气对厌氧微生物的抑制作用。

3.4发酵时间的累积控制

发酵时间也是影响酶催化反应速率和产物生成量的重要因素之一。通过控制发酵时间的长短可以调控微生物的代谢活动和产物的生成量。在实际操作中需要根据具体的发酵工艺和产物需求来确定合适的发酵时间范围。

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四、哪些类型的发酵需要控速

4.1高耗氧菌株

高耗氧菌株指那些在生长和代谢过程中需要大量氧气的微生物种类。这些菌株在消耗氧气方面效率较高，常见于各种基因工程菌，在生物降解、污水处理等需高氧环境的工业应用中。例如，枯草芽孢杆菌作为一种典型的高耗氧菌株，在废水处理中能够迅速消耗大量氧气，有效分解有机污染物，显著降低水体化学需氧量。其高效的耗氧能力使其成为环保领域的重要微生物资源。

4.2剪切力敏感菌株

对剪切力敏感的微生物主要包括但不限于以下几类：

a.植物细胞，植物细胞由于其细胞壁僵硬脆弱且胞内存在较大的液泡，对剪切力相对敏感。适当的剪切力可以促进细胞生长和增强代谢，但过大的剪切力会对细胞造成机械性损伤，降低细胞活性或破坏细胞膜结构，从而影响细胞生长代谢。具体例子：如红花细胞（Carthamus tinctorius L.），其耐受剪切力的阈值较低，当剪切力超过一定范围时，会影响细胞的生长和代谢。

b.乳动物细胞，哺乳动物细胞没有细胞壁，其细胞膜相对较为脆弱，容易受到外界机械力的影响。此外，哺乳动物细胞通常具有较大的尺寸，这使得它们更容易受到剪切力的影响。

c.柠檬酸发酵中的黑曲霉：柠檬酸黑曲霉作为柠檬酸发酵的主要生产菌，是一种剪切力敏感型微生物。其形态学特征会显著影响柠檬酸的产量。在柠檬酸发酵过程中，过大的剪切力可能会影响黑曲霉的生长和代谢，从而影响柠檬酸的产量。

d.不同生长阶段的细胞：植物细胞在不同生长时期对剪切的响应也不同。例如，处于对数期的红豆杉细胞对剪切力敏感。

剪切力对微生物的影响是一个复杂的过程，不仅与微生物的种类和生长阶段有关，还与剪切力的强度、持续时间以及环境条件等多种因素有关。在实际应用中，需要根据具体情况对剪切力进行控制和优化，以确保微生物的生长和代谢处于稳定的状态。

4.3原核类微生物

原核微生物则没有成形的细胞核，也缺乏内质网、高尔基体等细胞器，这限制了它们在蛋白质翻译后修饰和分泌方面的能力和速度。因此表达过程控速进行。

4.4分段控制类发酵工艺

补料类工艺、温敏类菌株、诱导类工艺、混菌类发酵、氧切换发酵、底物切换类发酵等都需要进行分段工艺设计，分段工艺在某些时期进行控速调节。

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五、控速阶段选择

5.1全程控速

如某些酒类的发酵过程追求低温长时发酵，由于发酵速度较慢，微生物有足够的时间来分解和利用原料中的成分，从而产生更多的风味和香气物质。这些物质能够赋予发酵制品独特的风味和香气，使得产品更加具有吸引力和竞争力。例如，在酿酒过程中，低温缓慢发酵有利于醇甜物质和酯类物质的形成，使得酒质更加醇厚、香气更加浓郁。

5.2生长期控速

生产大罐时期，对于生长偶联类微生物发酵有可能需要全程控速，将生长曲线的生长期做长，使得微生物更多的时间处于生长期，从而增加表达时间。

5.3种子期控速

生长过快会导致老化，有的时候也需要通过调整理化参数适配接种时间点等。