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一、包涵体定义

包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。

一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度（约1.3mg/mL），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。包涵体形成是比较复杂的，与胞质内蛋白质生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定形的蛋白质的聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件，如培养基成分、温度、pH值、离子强度等因素有关。细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性。

图1：包涵体

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二、包涵体对于发酵制品的影响

包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点。包涵体的形成对于重组蛋白的生产也提供了几个优势：

(1)包涵体具有高密度，易于分离纯化；

(2)组蛋白以包涵体的形式存在时可有效地抵御大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解；

(3)对于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒害的蛋白时，包涵体的形成无疑是不错的选择。

但是这些包涵体形式表达的蛋白通常是错误折叠的，因此不具备生物学活性，这将不利于发酵制品的应用，同时也不利于蛋白的结构分析以及蛋白组学的研究，所以大多数情况下都需要将不溶性的蛋白包涵体转化为可溶性的蛋白。

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三、包涵体的形成机理

(1)表达量过高：研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成的速率过快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键错误配对，过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。动力学模型表明：活性蛋白的产率取决于蛋白合成的速率、蛋白折叠的速率、蛋白聚集的速率(如图1所示)。在高水平表达时, 新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白正确折叠的速率就会导致包涵体的形成。

图2：蛋白质合成，折叠与聚集的示意图

(2)异源蛋白无法糖基化：重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，真核糖蛋白无法糖基化使中间体溶解度下降，导致不溶解的包涵体形成。

(3)阻扰折叠：重组蛋白分泌序列存在阻碍折叠，导致错误折叠分子的产生。

(4)含硫氨基酸：重组蛋白的氨基酸组成，一般来说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。

(5)中间体聚集：包涵体形成动力学研究表明，包涵体是由部分变性的中间体聚合而成。因此，任何影响中间体稳定的因素，如pH值(pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体)离子强度和温度都可以引起蛋白聚合反应。

(6)化学键：在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。

(7)培养条件差：有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。

(8)缺乏相关折叠酶及其它因子：重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等。

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四、包涵体解决方案

4.1防止包涵体的形成

1、与分子伴侣共表达

分子伴侣是一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能的组份。研究发现与分子伴侣共表达能有效的减少多肽链的错误折叠，提高蛋白的可溶性表达。该方式是利用基因工程技术将带有分子伴侣基因片段的载体与带有目的蛋白基因片段的载体共同转入宿主细胞中，共同在宿主细胞中表达。

分子伴侣是一个相互作用、相互影响的有机整体，如内质网氧化还原酶（Ero1）与分子伴侣二硫键异构酶（PDI）之间存在的相互作用，高庆华等学者通过单独表达蛋白质分子伴侣PDI和共表达PDI与Ero1，提高了重组葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的分泌表达。因此，在采用分子伴侣共表达的方式提高目的蛋白可溶性表达时应该根据目的蛋白的结构特征，选择合适的分子伴侣来优化表达组合。除此之外，还应该考虑分子伴侣与启动子、信号肽的组合以及发酵工艺条件等，进行条件优化设计研究。寒梅等研究者将人内皮他丁基因与GroEL-ES或DnaK-DnM-OrpE分子伴侣共表达，并在低温（16℃）条件下培养，目的蛋白的可溶性表达量比单独使用分子伴侣共表达的效果好。

目前，已经在大肠杆菌中发掘了2大类分子伴侣，即热休克蛋白Hsp60（包括GroEL和GroES）与热休克蛋白DnaK、Hsp70、GrpE及DnaJ。不同的分子伴侣具备不同的性能，分子伴侣既能独自起作用，也能协同发挥其作用。例如，GroEL（Hsp60伴侣蛋白家族）在可溶性和不可溶性蛋白质组分之间运输蛋白质，并积极参与解聚和包涵体的形成，DnaK（Hsp70伴侣蛋白家族）通过减少蛋白质聚集并促进蛋白聚糖来阻止错误折叠的蛋白质形成。另外，TaKaRa公司开发的5种分子伴侣组合可以确保几个不同的分子伴侣一起参与新生多肽的折叠，从而协助那些大多以无活性包涵体方式表达的蛋白质实现可溶性表达。此外，提高重组蛋白的可溶性表达还可以通过ClpB、GroEL-GroES和DnaK-DnaJ-GrpE伴侣系统及诱发因子的共同过度表达来实现。

2、基因改造

蛋白质的一级结构（氨基酸序列）是影响包涵体形成的重要因素之一。替换目的蛋白中的某个或多个氨基酸，可有效抑制包涵体的形成，增加目的蛋白的可溶性表达。这可能是由于突变后目的蛋白的疏水性发生了改变或者是由于重组蛋白的稳定性提高了。例如Jenkins T M等研究者将HIV-1整合酶的第185位苯丙氨酸突变成赖氨酸同时将第280位半胱氨酸突变成丝氨酸后，目的蛋白以可溶性的形式表达且整合酶的功能没有受到影响，而在没有进行定点突变并且其它条件完全一样的情况下，重组蛋白则以包涵体的形式表达。但是定点突变也可能会对目的蛋白的活性造成影响，因此为了使目的蛋白的可溶性表达提高的同时其活性不受影响，对目的蛋白的基因改造需要结合目的蛋白的结构以及活性特征。此外，研究者已经开始根据计算机模拟的同源模型有针对性地对目的蛋白的突变进行设计，大大地提高了重组蛋白的可溶性和活性。

由于蛋白结构的复杂性，目前结构与功能完全清晰的蛋白依然较少，绝大多数蛋白质的结构和功能至今都还未知，这在一定程度上限制了蛋白质的分子改造与设计的研究。因而定向进化的方法在蛋白质性能改良中依然具有特定的位置。常用的定性进化的易错PCR技术、化学诱变剂介导法、DNA改组等方法。易错PCR技术是一种变换进行PCR时各组分的用量和使用保真度低的Taq DNA聚合酶，进而使DNA复制时保真度减少，新链合成时碱基错配数增加，从而出现较多位点发生突变的扩增产物的一种DNA序列体外诱变的技术，是一种容易操作、有效的随机突变策略。化学诱变剂介导法是一种依据化学诱变剂处理连接了目的基因的载体之后从而产生随机突变，然后使用限制性核酸内切酶切割下已经突变的基因片段，重新连接到表达质粒之后转化进宿主菌中进行筛选的方法。

3、融合表达

20世纪后期以来，融合标签技术的出现与发展为外源蛋白质的可溶性表达带来了福音。融合标签不再局限于蛋白质的提纯与检测，新融合标签或能在蛋白折叠的过程中起作用，进而加强重组蛋白质的可溶性表达，或能增加重组蛋白的表达量。大部分融合标签是蛋白质，只有小部分是多肽片段。

实验探究结果显示那些容易形成包涵体的重组蛋白融合某些高度可溶的蛋白后，可溶性表达量增加。这些蛋白质主要包括麦芽糖结合蛋白(MBP)，谷胱甘肽S-转移酶(GST)，转录终止抗终止因子(NusA)，蛋白二硫键折叠异构酶(DsbA)以及硫氧还蛋白A(TrxA)等。其中MBP与GST两种融合标签发展的较早，主要应用于重组蛋白的亲和层析。经科学家们研究发现，MBP与不溶性的蛋白质融合后能加强外源蛋白的溶解性，但是融合标签GST只能有限的增强外源蛋白质的可溶性表达。科学家们的平行比较分析结果显示，通常情况下，增强外源重组蛋白可溶性表达能力强的是MBP，NusA增强溶解性的能力与MBP相当，也有部分研究人员认为TrxA增强重组蛋白可溶性表达的能力也与之相当。此外，DsbA能在那些含有二硫键的蛋白质之中发挥较好的作用。

目前，已经提出了5种关于融合标签提高重组蛋白可溶性表达机制的模型。

(1) “静电屏蔽”模型：通过带电蛋白质之间的静电斥力来减少乘客蛋白质分子的聚集。此类标签一般都具有强烈的负电荷，可直接参与帮助蛋白的正确折叠，例如Invitrogen公司研发的几种超酸性融合蛋白（如rpoD和yjgD），由于其带有很多负电荷，增大了新生肽链间的斥力，促使蛋白质之间的空间距离变大，很难产生聚集，乘客蛋白质也就有充足的时间进行准确折叠。

(2) “微囊体”模型：融合蛋白是通过细胞中产生的不完全折叠的由亲水性载客蛋白质包裹在外面，而疏水性蛋白质作为中心的微囊体(micelle)而具有很好的溶解性。例如，人体乳头瘤病毒E6与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合后形成微囊体模型结构从而表现为可溶性蛋白质。

(3) “熵锚”模型：载客蛋白质作为一个锚定蛋白质，使得折叠速度较慢的乘客蛋白质的运动受到限制，进而不容易聚集，故而能让乘客蛋白质在合适的熵条件下折叠。该模型的分析结果表示，不管融合标签在蛋白质的C端还是N端，其产生的熵都应该接近故增强蛋白质溶解性也应接近，可是研究发现融合标签加在不同的末端，可溶性表达效果差异明显。由此可以看出该模型并不能非常好的阐明蛋白质溶解性增强的机理。

(4) “伴侣磁铁”模型：同分子伴侣互相作用后的乘客蛋白质可以引导分子伴侣协助乘客蛋白质准确折叠。例如，铁蛋白重链能引导分子伴侣DnaK来协助乘客蛋白质折叠是由于其具有特定的序列，可以被DnaK识别并结合。

(5) “分子伴侣”模型：融合标签充当分子伴侣，同乘客蛋白质相互作用。据有关报道MBP就是一种可以充当分子伴侣的融合标签。

4、改变培养基

研究表明培养基的组成对提高重组蛋白的可溶性表达有显著的影响。首先培养基pH的稳定对重组蛋白的可溶性表达有重要影响，研究时应依据菌体与重组蛋白的特点来选择合适的pH值。培养基的pH值离重组蛋白的等电点pI越远，表达的目的蛋白就越不易形成包涵体。

图2：工业发酵培养基设计逻辑

其次，加入一些化学试剂也可能会提高重组蛋白的可溶性表达，例如一些TritonX-100、非代谢性糖类、乙醇等。可能的原因是一些非代谢性糖类，如蔗糖、山梨糖醇、甜菜碱、多元醇的存在会使培养基中的渗透压增加，从而会导致细胞质内渗透压防护剂积累，如甘氨酰—三甲铵乙内酯，能够抑制细胞质中的重组蛋白聚集，进而使得可溶性蛋白的表达水平提高。Black-well J R等研究者在培养基中添加了甜菜碱与山梨糖醇，使得可溶性的活性蛋白产量提高多达400倍。为了增加外膜的通透性，研究者在培养基中添加TritonX-100与甘氨酸。这两种化学物质都可以破坏细胞外膜的完整性，能够改变细胞外膜的通透性，并且不会引起明显的细菌裂解。例如唐金宝等研究人员在培养基中添加了终浓度为1％的Triton X-100和1％的甘氨酸，使得ProZZ-EGFP基因在培养基中的可溶性表达量提高6倍。

5、降低重组蛋白的合成速率

蛋白动力学模型的研究表明在高水平表达时，新生多肽链的聚集速度一旦超过了蛋白质折叠的速度就会形成包涵体。因此可以通过降低重组蛋白的合成速率，使重组蛋白的可溶性表达提高。常用的方法包括选择合适的启动子、降低培养温度、选择合适的诱导时间和诱导温度以及使用较低浓度的诱导剂。

培养温度降低有利于降低重组蛋白的合成速率，可能原因是在低温条件下，细菌生长比较缓慢，目的蛋白的合成也就相应较慢，新合成的蛋白能够有更充足的时间进行折叠。同时培养温度降低也可以降低重组蛋白的降解速率，从而使重组蛋白的稳定性提高。Sim B J等研究人员将scIPNS基因在大肠杆菌表达系统中表达时，37℃条件下形成的是没有活性的包涵体，而在28～25℃下获得了可溶性表达，并且在25℃时起可溶性表达量较高，大约占总菌体量的29％。虽然培养温度降低能提高外源蛋白可溶性表达，但是也会有一个下限，一般为8-10℃，因为培养温度低于该温度时，大肠杆菌就会停止生长，蛋白质也就基本停止表达了。

诱导时间和诱导剂的用量也是控制可溶性外源蛋白表达的重要因素。诱导剂种类及其浓度都会对外源蛋白表达产生重要影响，应根据所采用的表达系统(比如启动子的强弱)和外源蛋白的特点优化选择。摇瓶培养时，应选用低菌体浓度诱导，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白。然而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达。在某些情况下，诱导剂的流加能显著提高可溶蛋白的表达水平。

6、选择合适的表达系统

包涵体的发生很大原因取决于二硫键的形成和多肽是否正确折叠，因此可以选择利于二硫键形成的宿主菌，例如Rosetta Origami(DE3), Origami(DE3)和Origami B(DE3)等。选择合适的表达系统取决于重组蛋白的特性（例如重组蛋白的大小、二硫键的数目、目的蛋白的定位以及所需的翻译后修饰的类型），重组蛋白的预期应用（其应用领域包括结构研究、体内研究、体外活性分析和作为抗原制备抗体）以及该系统能否生产足够量的蛋白质。

真核表达原核蛋白

—般来说，在选择重组蛋白的表达宿主时，对来源于原核生物的蛋白来说，应当只选择大肠杆菌进行表达，而不是真核表达系统，这是由于真核生物的改善的折叠能力与翻译后修饰能力对于原核蛋白来说是非必要的。

原核表达真核蛋白

而对于真核蛋白来说情况就不一样了，因为有大量的实例表明，真核蛋白能在大肠杆菌中进行成功地表达。但是当使用原核系统表达真核蛋白时，需要考虑大肠杆菌对密码子使用的偏性，一般通过密码子优化可以避免这个问题。在大多数情况下，如果重组序列是在亲缘关系很远的宿主中表达，也需要对密码子偏性进行矫正。

4.2

包涵体的复性步骤

1、菌体的收集和破碎

提取的第一步是冷却发酵液，由于包涵体比细胞可以耐受更大的剪切力，所以可以使用的破碎细胞的方法有很多。包涵体可以使用过滤或者离心的方法，把细胞破碎液中的其它成分除去用离心的手段可以把包涵体与细胞的其它成分分离开来。

2、包涵体的洗涤

包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris, pH7.0-8.5, 1mM EDTA中洗涤包涵体。此外可以用温和的去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液中的离子轻度升高而增强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的氯化钠，使得包涵体的纯度提高。具体操作可参考如下方式：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。重复2-3次。再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃ 12000 rpm离心15 min，弃去上清液。

3、包涵体溶解

变性剂如尿素、盐酸胍主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽链延伸。盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素无法溶解的包涵体。两种常用变性剂的比较如表1所示。SDS、正十六烷基三甲基氨氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的二硫键，溶解一些蛋白质。

另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需要加入还原剂，如巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）、半胱氨酸等。这种还原剂能同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。二硫键的形成和断裂是可逆的，直到有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被打破。

表1：两种常用变性剂的比较

如将沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton）重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。

4、包涵体复性

复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性开始，到2M左右时结束；而盐酸胍可以从4M开始到1.5M时结束。复性的方法主要有透析复性，柱上复性和稀释复性，三者的比较表2所示。

表2：常用复性技术的比较

5、结果分析

包涵体复性后，需要用一个可靠的方法来检验重组蛋白的天然构象，计算复性收率。主要有酶活性分析，RP-HPLC，分光光度，配基结合，ELISA和生物学分析。